El 20 de enero de 1502 fue alcanzada la Bahía de Guanabara por los exploradores portugueses en una expedición encabezada por el explorador portuguésGaspar de Lemos, en la cual participaba el navegante italiano Americo Vespuccio. La presencia europea en la zona comenzó poco después. En 1519 cuandoFernando de Magallanes atracó sus buques en la bahía, contrabandistas franceses ya utilizaban la bahía como un puesto para el contrabando de palo brasil. Cuando el oficial naval francés Nicolas Durand de Villegaignon llegó en 1555 con una flota de dos buques y 600 soldados y colonos, fundó el primer asentamiento europeo permanente en la zona. La colonia fue denominada Francia Antártica. Los colonos consistían principalmente de hugonotes franceses y calvinistas suizos.

La ciudad fue fundada el 1 de marzo de 1565, por el militar portugués Estácio de Sá, con el nombre de São Sebastião do Rio de Janeiro (San Sebastián del Río de Enero). Durante siglos, el asentamiento se llamó São Sebastião, en lugar de la actualmente popular segunda mitad de su nombre. La ciudad fue fundada como una base desde la cual invadir el asentamiento francés, que finalmente se logró en 1567 y los franceses fueron expulsados.

A fines del siglo XVI, Río era un lugar estratégico en el Atlántico para el tránsito de buques entre Brasil, las colonias de África y Europa. Se construyeron fortalezas y se formó una alianza con las tribus nativas cercanas para la defensa de la ciudad. La caña de azúcar fue la primera industria en la zona. En primer lugar se utilizaban nativos, pero más tarde los esclavos de África fueron utilizados para estos trabajos manuales.

Hasta comienzos en el siglo XVII, la ciudad se vio amenazada o invadida por piratas y bucaneros franceses, como Jean-François Duclerc y René Duguay-Trouin. Después de 1720, cuando los portugueses encontraron oro y diamantes en la vecina capitanía de Minas Gerais, Río de Janeiro pasó a ser mucho más útil que Salvador de Bahía como puerto para exportar la riqueza, ya que esta estaba mucho más al norte.

Durante casi todo el siglo XVII, la ciudad tuvo un desarrollo lento. Con cerca de 30 000 habitantes en la segunda mitad del siglo XVII, Río de Janeiro se convirtió en la ciudad más populosa de Brasil, e iba a tener una importancia fundamental para el el dominio colonial. Esta importancia se hizo aún mayor con la exploración de yacimientos de oro en Minas Gerais, en el siglo XVIII: la proximidad llevó a la consolidación de la ciudad y centro económico y el puerto.

En 1763, la administración colonial portuguesa en América se trasladó a Río. La ciudad continuó siendo principalmente la capital colonial hasta 1808, cuando la familia real portuguesa y la mayoría de los asociados nobles de Lisboa, que huían de la invasión napoleónica de Portugal, se trasladaron a Río de Janeiro. La capital del reino de Portugal fue trasladada a la ciudad, que, por lo tanto, se convirtió en la única capital europea fuera de Europa.